Разработка способов обеспечения стабильности микробиологических показателей продуктов питания, совершенствование методов контроля за их безопасностью

УДК 616.34-008.87:316.34-008.87


На правах рукописи


ХАДЖИБАЕВА ИРИНА ФАНАВИЕВНА

Разработка способов обеспечения стабильности микробиологических показателей продуктов питания, совершенствование методов контроля за

их безопасностью

14.00.07 - гигиена

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Республика Казахстан Алматы, 2006 г.


Работа выполнена в Казахской академии питания

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор                                                                                                    Каламкарова Л.И.

Научный консультант:

доктор биологических наук,

профессор                                                                                                    Багрянцева О.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор                                                                                                    Синявский Ю.А.

кандидат биологических наук,                                                                Рахимберлина Р.М.

Ведущая организация: Карагандинская государственная медицинская академия

Защита состоится «_18_» мая 2006 года в _15_00 на заседании Объединенного диссертационного совета ОД.53.28.01 при Казахской академии питания по адресу: г.Алматы, ул.Клочкова, 66.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казахской академии питания

Автореферат разослан «___ » _ 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук                                                     Урбисинов Ж.К.


Введение

Актуальность. В последние десятилетия отмечается значительный подъем заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами (УПМ) - стафилококками, энтеробактерами, энтеропатогенными кишечными палочками, клебсиеллами, синегнойной палочкой, дрожжеподобными и плесневыми грибами и т. п. Серьезность сложившейся ситуации усугубляется растущей частотой встречаемости антибиотикоустойчивых штаммов в продуктах питания, которые могут стать причиной развития эндо- и экзогенных инфекций в организме человека. Распространению этих штаммов способствует широкое и часто неоправданное применение антибиотических препаратов в практике лечения различных воспалительных заболеваний человека и животных [Страчунский Л.С., 2000; Acar J. et all., 2001; Witte W. et all., 2000].

Поэтому, в целях предотвращения развития антибиотикоустойчивости у микроорганизмов, чаще всего высеваемых из продуктов питания, является актуальным разработка более эффективных схем их идентификации и совершенствование методов индикации остаточных количеств антибиотиков в продовольственном сырье и продуктах питания.

Кроме того, стремление обеспечить людей максимально широким ассортиментом пищевых продуктов независимо от времени и места производства вызвало необходимость разработки новых способов обработки сырья и готовых продуктов с целью предупреждения порчи и увеличения сроков хранения. Среди таких способов особое значение на современном этапе имеет консервирование с применением пищевых добавок - антисептиков, антибиотиков и антиокислителей, способствующих сохранению продуктов питания. Однако, как показали исследования, многие применяемые консерванты могут вызывать изменение биологических свойств микроорганизмов, повышая их устойчивость к различным химическим агентам, и могут влиять отрицательным образом на биохимические процессы и микробиоценоз человека [Донченко П.В. с соавт., 1999; Люк Э. с соавт., 1998].

Эту проблему в значительной степени можно решить, обосновав возможность применения нового спектра веществ, обладающих как консервирующими свойствами, так и способностью улучшать обмен веществ организма. В их число входят растительные сахара и эфирные масла.

Однако, как показывает мировой опыт, внесение в продукты ряда пищевых добавок в превышающих допустимые уровни дозах может оказывать отрицательное действие на организм человека. Поэтому, является важным усовершенствовать схему оценки качества и безопасности продуктов питания при внесении в них биологически активных компонентов, Данная оценка требует тщательного исследования влияния этих добавок на качество продуктов питания, а также наличие у них бактериостатического эффекта, который может повлечь развитие дисбиотических состояний кишечника. Для решения этой задачи была использована йод содержащая добавка к пище


«концентрат йода», используемая в промышленности для производства восстановленного йодированного молока. [Бозаджиев Л.Л с соавт., 2001; Цыб А.Ф., с соавт., 2000].

Цель исследования: Разработка способов обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов, содержащих биологически активные компоненты с бактериостатическими и бактерицидными свойствами.

Задачи исследования:

1.   Совершенствование методов гигиенической экспертизы продуктов
питания на наличие в них антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов
и остаточных количеств антибиотиков:

-  Сравнительная оценка спектра антибиотикорезистентности патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из пищевых продуктов и биологического содержимого человека.

-            Расширение мониторинга за распространенностью антибиотикоустойчивых штаммов бактерий семейства Enterobacteriaceae в продуктах питания.

- Совершенствование микробиологического способа индикации антибиотиков в кисломолочных продуктах.

2.  Научное обоснование применения ряда растительных сахаров, ранее не
применявшихся в пищевой промышленности (арабиноза, манноза, ксилоза,
рибоза, рамноза, галактоза), в качестве консервантов.

3.    Исследование возможности применения бактерицидных свойств
пихтового масла в пищевой промышленности.

4.  Исследование влияния йодсодержащей пищевой добавки на показатели
качества и микробиологической безопасности молочных продуктов питания.

Научная новизна:

- Выявлен высокий процент антибиотикоустойчивых штаммов, выделенных из продуктов питания. Показано, что на территории Республики Казахстан в настоящее время контаминация продуктов питания антибиотикоустойчивыми штаммами происходит преимущественно в результате их распространения за счет бактерионосителей, применявших в практике лечения воспалительных заболеваний антибактериальные препараты.

-Разработана новая высокоэффективная схема дифференциации антибиотикоустойчивых бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделенных из продуктов питания, которая предусматривает использование комплексных питательных сред КПС 1 и КПС 2 и компьютерной программы, повышающая эффективность их индикации и идентификации.

-Усовершенствована схема индикации антибиотиков в молочных продуктах.

-Впервые показана возможность и эффективность использования растительного сахара арабинозы в качестве консерванта в пищевой промышленности.


-Научно обоснована возможность удлинения сроков хранения мясных и колбасных изделий при использовании в качестве консерванта пихтового масла в сочетании с уксусной кислотой.

-Научно обоснован способ приготовления йодированного молока. который не оказывает отрицательного воздействия на показатели качества и безопасности молочных продуктов.

Основные положения, выносимые на защиту:

-Усовершенствованные методы гигиенической экспертизы продуктов питания на наличие в них антибиотикоустойчивых штаммов бактерий и остаточных количеств антибиотиков.

-Возможность применения в качестве консервантов новых биологически активных веществ, способствующих повышению биологической ценности продуктов питания и удлинению сроков их хранения.

-Способ получения йодсодержащих функциональных продуктов питания на основе молока.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции "Стратегия развития здравоохранения Казахстана в 21 веке" (Алматы, 2001); республиканской научно-практической конференции "Вопросы питания и регуляции гомеостаза" (Душанбе, 2002); международной научно-практической конференции "Совершенствование лабораторной диагностики патологических состояний" (Алматы, 2003), международной научно-практической конференции " Национальная политика здорового питания Республики Казахстан" (Алматы, 2004), заседании ученого совета Казахской академии питания (Алматы, 2004), заседании лаборатории контроля качества и безопасности продуктов питания Казахской академии питания (Алматы, 2005).

Практическая ценность работы:

- Выявление аналогичного спектра антибиотикоустойчивых штаммов из биоматериалы человека и продуктов питания свидетельствует о необходимости расширения мониторинга за изменением биологической активности изучаемых штаммов, что может сыграть большую роль в контроле за применением антибиотиков в терапии и различных заболеваний.

- Предложенные методы гигиенической экспертизы продуктов питания на наличие в них антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов и остаточных количеств антибиотиков, позволят проводить контроль их качества и безопасности в более короткие сроки и с большей эффективностью. Способ идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae при помощи комплексных питательных сред и компьютерной программы «Микротест» вошел в «Инструкцию по расследованию пищевых отравлений» (Утверждена МЗ РК 29.01.96 за №4.04.002-96) и широко используется в работе санитарно-эпидемиологических станций РК всех уровней.


-Использование арабинозы, пихтового масла в сочетании с уксусной кислотой в качестве консервантов в пищевой промышленности целесообразно при разработке новых функциональных продуктов питания с длительными сроками хранения, обладающих антиоксидантными и иммуностимулирующими свойствами.

-Разработанный метод йодирования молока с использованием концентрата «Йод ВИЛА» в молочной промышленности позволяет получать функциональные и лечебно-профилактические продукты питания, предназначенные для профилактики йоддефицитных состояний у пациентов с ограниченным содержанием соли в пище, при сохранении показателей их качества и микробиологической безопасности.

Согласно разработанным технологическим условиям, на базе ТОО «Обис-Аукат» произведена выработка пробной партии молочных продуктов «Йогурта» и «Фруктово-ягодного напитка на основе сыворотки», содержащих концентрат «ЙодВИЛА».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ и в том числе 1 патент.

Личный вклад автора.

Проведение микробиологических исследований, обработка и анализ всех полученных результатов, их обсуждение и интерпретация, формулировка основных и выводов по работе выполнены соискателем лично. Анализ физико-химических показателей продуктов проводился сотрудниками группы химических исследований лаборатории контроля качества и безопасности продуктов питания Казахской Академии питания.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обобщения и анализа результатов исследований, выводов и списка использованной литературы, который включает 236 источника. Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 8 рисунков и приложения.

Связь диссертации с планами НИР. Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательских программ Казахской академии питания «Совершенствование бактериологической диагностики качества продуктов питания и обеспечение их безопасности» (гос.регистрации №01.8.90042739 шифр темы 027), «Влияние некоторых физико-химических и биологических факторов на эпидемиологическую значимость микроорганизмов в этиологии желудочно-кишечных заболеваний, разработка методов их диагностики, терапии и профилактики » (гос.регистрации №0100 РК 00640).

ІОбзор литературы 1.1 Распространенность и некоторые закономерности формирования резистентности к антибиотикам микроорганизмов

Антимикробные средства, способствующие формированию антибиотикорезистентных штаммов, являются широко применяемой в лечебных целях группой лекарственных средств, как у человека, так и у


животных. Они также используются в качестве добавок в пищу сельскохозяйственных животных и птицы для стимуляции роста и в пищевой промышленности в качестве консервантов [ Кукулянский А. А., 1991; Гуфрій

Дмитро, 2000;].

Формирование и распространение устойчивых вариантов штаммов бактерий - комплекс сложных биологических процессов, зависящих от свойств микроба, его генетической структуры, особенностей используемых препаратов и т. д., а также антропогенных факторов таких, как практика применения антибиотиков и консервантов, ее длительность, социальные и экономические условия, интенсивность миграции [Зубов Л.А., с соавт., 1998; Багрянцева О.В., 2000; Черныш Л.П., с соавт. 2000.]. Поэтому является важным проследить пути формирования антибиотикоустойчивых штаммов и разработать методы идентификации микроорганизмов, являющихся наиболее частой причиной пищевых отравлений, а также усовершенствовать методы эффективной индикации антибиотиках в пищевом сырье и продуктах питания.

1.2 Научно-гигиеническое обоснование совершенствования способов дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae

Идентификация энтеробактерий в настоящее время проводится на основании дифференциально-диагностических тестов, разработанных ведущими организациями [Грачева М.Н., с соавт., 1989; Пивоваров Ю.П., с соавт., 1982]. Для более удобной идентификации микроорганизмов разработаны упрощенные методы - кодовые таблицы, схемы-ключей и каталоги кодов. В последнее время сделаны, попытки автоматизировать процесс распознания с использованием вычислительной техники [Васильев

Д.А., с соавт., 2000].

1.3 Антимикробное действие консервантов

В настоящее время в пищевой промышленности и при домашних заготовках применяются бактерицидные добавки, которые позволяют дольше сохранять натуральные качества, питательные свойства и биологическую ценность пищевых продуктов. Консерванты в пищевых продуктах замедляют рост и развитие бактерий, плесневых грибов и дрожжей, а также обмен веществ в них. При добавлении консерванта в пищевой продукт микроорганизмы могут погибнуть или продолжить расти - результат зависит от концентрации консерванта [Каламкарова Л.И., с соавт.,2001; Чепурной И., 2000]. Однако применение консервантов может способствовать формированию устойчивости микроорганизмов к воздействию различных факторов, а также оказывать неблагоприятные влияние на организм человека.

1.4    Проблема йоддефицита в Республике Казахстан и пути ее
решения

В продуктах питания большое значение имеет содержание микроэлементов, в частности йода, который входит в состав тиреоидных гормонов, на долю которых приходится до 90% циркулирующего в крови органического йода [Базарбекова Б.Б., с соавт.,2003].

Некоторые из последствий йодной недостаточности в случае их возникновения имеют необратимый характер, но все они могут быть полностью


предупреждены с помощь легко доступных способов добавок йода. Таким образом, специалисты по планированию здравоохранения и международные организации во все большей степени признают, что ликвидация йодной недостаточности - достижимая цель, которая принесет существенную пользу многим людям [Сухинина С.Ю., с соавт., 1995]. В настоящее время в РК для этого широко используется йодизация соли. Однако в ряде случаев содержание соли в рационе ограничивается. Поэтому необходимо проводить поиск других альтернативных методов профилактики йоддефицита.

2 Материалы и методы исследований

Проведен сравнительный анализ антибиотикорезистентности микроорганизмов в период с 1997 по 2000 гг., выделенных из биологического материала и продуктов питания. Исследованы следующие микроорганизмы: Esherichia coli, Enterobacter sp., Serratia sp., Hafnia sp., Klebsiella sp., Yersinia sp., Proteus sp., Salmonella sp., Citrobacter sp., Staphylococcus aureus (всего 2258 штаммов) к 21 антибиотикам (бензилпенициллину, ампициллину, карбенициллину, цефазолину, цефалексину, цефалотину, ципрофлоксацину, фузидину, олеандомицину, линкомицину, доксициклину, левомицитину, рифампицину, полимиксину, стрептомицину, тетрациклину, гентамицину, канамицину, офлоксацину, фуразолидону, фуродонину). Оценка чувствительности изучаемых штаммов микроорганизмов к антибиотикам проводилась общепринятыми методами диффузии в агар с использованием дисков согласно методическим указаниям Гивенталь Н.И., с соавт. [1983].

Для совершенствования способов идентификации бактерий семейства Enterobacteriacae были использованы комбинированные питательные среды КПС№1 и КПС№2, проанализированы применяемые в практике схемы-ключи Пивоварова Ю.П. с соавт. [1982], Грачевой М.Н., с соавт. [1989], биохимических тестов Покровского В.И. с соавт. [1995], Горьковского НИИЭМ [1989] При проверке правильности разработки схем-ключей были использованы штаммы микроорганизмов принадлежащих к следующим родам Salmonella, Edwardsiella, Citrobacter, Esсheriсhia, Enterobacter, Serratia, Hafnia, Klebsiella, Yersinia, Shigella, Proteus, Morganella, Xenorhabdus (всего 350 штаммов).

Проведен анализ степени загрязнения остаточными количествами антибиотиков 3892 проб пищевых продуктов в период с 2000-2004 гг, зарегистрированные ГорСЭУ и испытательной лабораторией ТОО «НУТРИТЕСТ» по Казахстану.

Определение присутствия антибиотиков в кисломолочных продуктах (кефир, ацидолак, ряженка, йогурт, сметана и др.) было проведено двумя общепринятыми методами утвержденным Госстандартам РК № 3049­84/10.05.029.97. [1985], № 4.2.026-95/ 10.05.036.99 [1995].

Для изучения действие растительных сахаров на рост тест-культурах микроорганизмов: Salmonella enteritidis, Proteus vulgaris, Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Candida albicans, Penicillum sp., Aspergillus sp. в концентрации 106 КОЕ/г.


использовались следующие растительные сахара: сахароза, глюкоза, арабиноза, галактоза, мальтоза, ксилоза, дульцид, рафиноза, рамноза, маннит, мезо-инозит, лактоза, манноза, рибоза, сорбит. Оценка бактериостатического действия сахаров проводилась в концентрациях 50, 25, 12 и 6 мас.%, которые достигались при помощи проведения последовательных разведений в питательных средах (пептонной воде или бульоне Сабуро).

При обосновании возможности использования бактерицидных свойств пихтового масла в пищевой промышленности было использовано пихтовое масло производства России (ТУ ОСТ 13-221-86). Проведен анализ его сочетанного действия с различными органическими кислотами: янтарной, уксусной, молочной, лимонной, аскорбиновой на рост Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterobacter agglomerans, Hafnia alvei, Salmonella typhymurium, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus flavus, Penicillium sp., Cladosporium sp. в концентрации 106 КОЕ/мл. методом серийных разведений консервантов на бульоне Хотингера и бульоне Сaбуро. Через 24 часа инкубирования при температуре 370С (в случае с грибами при 250С) производили высевы на соответствующие для каждого организма плотные питательные среды. Для изучения консервирующего эффекта пихтового масла в сочетании с различными органическими кислотами был поставлен опыт с использованием мясного фарша. При этом фарш вместе с 2 мас.% пихтового масла, янтарной и уксусной кислотами в концентрациях 3; 1,5 мас.% автоклавировался при 1 атмосфере в течение 30 минут. Затем засевался суспензией микроорганизмов в расчете 106 КОЕ/г. Первый высев на плотные питательные среды производился через 24 часа инкубации, повторный - через 5 суток после начала постановки опыта.

Оценка возможности использования йодированной пищевой добавки для производства восстановленного йодированного молока и для получения йодированных молочных продуктов проводилась с использованием «Концентрат йода», полученный от ЗАО «ЙодВИЛЛ».

Определение антимикробной активности водных растворов и молока с
различный концентрацией йода (0,32; 0,16 и 0,08 мг/л) проводилось с
использованием               следующих        тест-культур условно-патогенных

микроорганизмов: Salmonella interitidis, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Candida

2         3 9

albicans с титром КГ, 10 и 10 КОЕ/мл.

Наработку молочных продуктов «Йогурта» и «Фруктово-ягодного напитка на основе сыворотки» проводили согласно технологическим инструкциям, рецептуре на базе ТОО «Обис-Аукат».

Гигиеническую оценку наработанной продукции проводились согласно требованиям в ТУ 640 РК 39078219 ТОО-03-2000 и ТУ 640 РК 39078219 ТОО-

04-2000 и ГОСТам 9225-84 по показателям МАФАнМ, БГКП (колиформы),

S.aureus, патогенные, в том числе сальмонеллы. По ГОСТам 3625-84, 3624-92 определяли содержание влаги, плотности, кислотности. При определении углеводов  и энергетической  ценности  продуктов  использовался сборник


химического состава пищевых продуктов И.М. Скурихина [1998]. Анализ содержания йода в водных растворах и в восстановленном молоке проводили "Полуавтоматическим методом установления количества йода в пищевых продуктах"[1991].

Влияние концентрата йода на микробоценоз кишечника проводили на 12 беспородных белых мышах (2 группы по 6 животных) путем его перорального введения при помощи зонда в течение 30 дней по 1 мл. Контрольные животные получали физиологический раствор (6 животных). При этом проводилось определение общего микробного числа аэробов, клостридий, бифидобактерий, лактобацилл, энтерококков, колиформных микроорганизмов, стафилококков, дрожжеподобных и плесневых грибов.

Все используемые в работе штаммы тест-микроорганизмов были типичными по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам в соответствии с «Определителем Берджи»[1997] и Д. Саттона [2001]. Прописи основных и элективных сред использованы из «Справочника по микробиологическим и вирусологическим методам исследований» [1982] и «Микробиологии с техникой микробиологических исследований» [2004].

Полученные результаты обработаны на персональном компьютере с применением методов вариационной статистики, корреляционного и однофакторного дисперсионного анализов. Достоверность оценивали по критерию Стьюдента [Лакин Г.Ф., 1980].

3 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 3.1 Устойчивость к антибиотикам микроорганизмов, выделенных из биологического материала людей и продуктов питания

Рисунок 1- Удельный вес различных групп микроорганизмов, выделенных из продуктов питания животного происхождения



Исследования продуктов питания животного происхождения на наличие в них патогенной и условно-патогенной флоры включало 769 проб продуктов питания. Было выделено штаммов - золотистого стафилококка в монокультуре (20 %), золотистый стафилококк в сочетании с энтеробактериями ( 22 %) и -энтеробактерии (58%). (Рисунок 1).


Исследование частоты высеваемости энтеробактерий, принадлежащих к различным родам выявило, что чаще всего в продуктах питания обнаруживались E.coli - в 27,3% случаев. Частота обнаружения бактерий рода Enterobacter составила - 15,6%, Serratia - 12,9%, Citrobacter - 10,7%, Proteus -9,4%, Klebsiella - 8,4%, Hafnia - 7,0%, Salmolella - 5,9%, Yersinia - 2,7% (Рисунок 2.).


ffl

I-o I-

o

T

3" .2-

X

I-с


30,0% 25,0% 20,0% 15,0% 10,0% 5,0%

0,0%


8


27,3%

15,6%

О tO -Q

© со 12,9%

10,7%

о

tO -Q .O

a


9,4%

со


8,4%

to

CO


.to

7,0% 5,9%

■S5

© С О

<§■

to со


.to


2,7%


Наименование микроорганизмов

Рисунок -2 Частота встречаемости бактерий сем.Enterobacteriaceae в продуктах питания животного происхождения

Далее, с целью выявления наиболее вероятных путей контаминации продуктов питания антибиотикоустойчивыми микроорганизмами на территории Республики Казахстан, было проведено сравнительное исследование этого признака у 2258 штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из биологического материала людей и продуктов питания. Антибиотикорезистентность штаммов к 21 наиболее часто применяемым в практике лечения воспалительных заболеваний антибиотику проверялась методом диффузии в агар.

В результате было выявлено, что устойчивость к антибиотикам наблюдалась в 1,06-1,69 раза чаще у штаммов, выделенных из биоматериала людей, чем из продуктов питания. При этом спектр резистентности у обеих сравниваемых групп практически совпадал, что дало основание сделать заключение о том, что на территории Республики Казахстан в настоящее время распространение антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов происходит преимущественно за счет бактерионосителей, применявших антибактериальные   препараты.   От   них   антибиотикоустойивые штаммы


попадают в различные объекты окружающей среды, в том числе и в продукты питания (Рисунок 4).

наименование а/ка                                       □ продукты питания

□ биоматериал

Рисунок 4 - Процент устойчивых штаммов S.aureus, выделенных из продуктов питания и биоматериала

3.2 Совершенствование способов дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделяемых из различных объектов окружающей среды и биоматериала человека

В процессе проведения данной работы для более точной дифференциации и повышения эффективности проводимых анализов была разработана схема проведения идентификации энтеробактерий, являющихся наиболее частой причиной эндогенных инфекций и пищевых отравлений, включающая использование комплексных питательных сред КПС№1 и КПС№2 и компьютерной программы «Микротест», которая позволяет определить вероятность   присутствия  исследуемого   микроорганизма  и  указать тест,


использование которого даст возможность идентифицировать виды, близкие по своим биохимическим свойствам. На способ приготовления среды КПС №2 нами был получен патент Государственного патентного ведомства РК за № 15826 от 13.10.94.

Использование питательных сред позволяет исследователю определить одновременно 10 основных культурально-биохимических характеристик энтеробактерий и сократить время проведения анализа с 72 до 24 часов. Определение этих характеристик, в сочетании с рядом дополнительных признаков, позволяет сократить перечень определяемых родов бактерий и, при помощи компьютерной программы «Микротест» более рационально выбрать тесты для их дальнейшей дифференциации. При применении программы «Микротест» идентификация до вида проводилась в 100 % случаев. Сравнительные результаты определения биохимической активности энтеробактерий при помощи тестов разработанных Ю.П.Пивоваровым, М. Н. Грачевой и Горьковским НИИМ выявили корреляцию результатов от 55 % (по Грачевой) до 100% (по Покровскому). (Рисунок 3.).

Исследуемый материал





щи

щ

Идентификация


Рисунок - 3 Схема бактериологического исследования с использованием программного обеспечения «Микротест»

3.3     Анализ     степени     контаминации     продуктов питания антибиотиками в Казахстане за период 2000-2004гг.

Необходимо        помнить        об        опасности распространения антибиотикоустойчивых штаммов и через сельскохозяйственных животных.


Антибиотикорезистентность может формироваться в данном случае в результате использования антибактериальных препаратов для лечения животных, а также при добавлении в корм, когда они применяются с целью профилактики заболеваний животных. [Петрова Е.И., 2005 ].

Результаты исследования пищевого сырья и продуктов животного происхождения подтвердили возможность существования этого пути образования антибиотикоустойчивых штаммов в РК. Так, исследование 1946 проб продуктов питания в период с 2000 по 2004 гг. на наличие остаточных количеств антибиотиков показало, что в 1,12% случаев зарегистрировано превышение предельно допустимых уровней их содержания в продуктах. Остаточные количества антибиотиков были обнаружены в 10 пробах молочных продуктов (пенициллин - в 6 пробах и пенициллин+стрептомицин - в 4 пробах) и 13 пробах мяса птицы и продуктов ее переработки (стрептомицин - в 11-ти пробах и тетрациклин - в 2-х пробах). Ни в одной из исследованных проб не были выявлены левомицин, гризин и цинкбацитрацин, являющиеся обязательными показателями при проведении исследований согласно действующего СанПиНа 4.01.071.03. Следует отметить, что процент обнаружения остаточных количеств антибиотиков в продуктах питания в Республике Казахстан несколько меньше, чем в других странах. Так, например, во Франции и Англии он составляет 3,9 и 11 %. Этот факт обуславливается, по-видимому, во-первых, меньшей частотой использования антибиотиков в животноводстве РК и, во-вторых, недостаточной точностью используемого в этих целях, согласно ГОСТ РК, метода их выявления, погрешность которого составляет 10%. (Рисунок 5)

3.4 Способ индикации антибиотиков в кисломолочных продуктах

Для улучшения контроля за контаминированностью антибиотиками продуктов питания нами был усовершенствован способ пробоподготовки при индикации антибиотиков в продуктах питания при помощи используемых в настоящее время методов исследования (Методические указания № 3049­84/10.05.029.97 и №4.2.026-95/ 10.05.036.99). Предлагаемый способ позволяет с большой точностью определять их присутствие в кисломолочных продуктах (кефир, ацидолак, ряженка, сметана и др.). Его разработка была необходимой также потому, что содержащиеся в этих продуктах кисломолочные бактерии могут оказывать ингибирующее действие на рост тест-культур, применяемых при постановке методов определения остаточных количеств антибиотиков микробиологическими методами.

Проведенный сравнительный анализ усовершенствованного и общепринятого методов исследования кисломолочных продуктов на содержание в них антибиотиков (левомицетина, тетрациклина, стрептомицина, пенициллина), вносимых в продукт в известных концентрациях, показал большую точность модифицированного метода по сравнению с общепринятым. Его ошибка составила 3%. Кроме того, его использование помогает избежать ложноположительных результатов.


о

CL


20 И


молоко и молочные продукты 1668 проб


22


мясо птицы и продукты

переработки 390 проб



15


12


8


о с; о


10


5

4

0

□ пенициллин

□ пенициллин+стрептомицин

□ стрептомицин

□ тетрациклин

Рисунок - 5 Абсолютные значения содержания остаточных коли честв антибиотиков в пробах продовольственного сырья и пищевых продуктов за период 2000-2004 гг.

3.5 Изучение возможности использования бактерицидных свойств пихтового масла в пищевой промышленности

Известно, что при обработке упаковочного материала для мясопродуктов чаще всего применяются двуокись серы и ее производные, гексамитилентетрамин или уротропин. При этом сернистый ангидрид обладает способностью разрушать тиамин и биотин, способствует окислительному распаду токоферола - витамина Е. Бактерицидное же действие гексамитилентетрамина обусловлено образованием формальдегида в кислой среде - сильного дезинфицирующего и канцерогенного вещества. Кроме того, эти вещества в определенных концентрациях могут оказывать отрицательное воздействие на организм человека.

Поэтому перед нами встала задача исследовать возможность использования в мясной промышленности более безопасного для человека


вещества, давно используемого в народной медицине, - пихтового масла, которое обладает, по данным литературных источников, не только бактерицидным эффектом в отношении микроорганизмов, но и антиоксидантными свойствами. Выбор пихтового масла был определен во-первых тем, что древесина и хвоя пихты давно используется при приготовлении копченых колбас, во-вторых, пихтовое масло давно используется в медицине, благодаря широкому спектру бактериостатического и фунгицидного действия в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Кроме того, было установлено, что введение эфирных масел в среду с повышенным содержанием белка незначительно отражается на их бактериостатической активности.

В результате проведенных экспериментов было выявлено, что минимальная ингибирующая концентрация пихтового масла составила для стафилококков, энтерококков и бациллюсов - 4 мас.%, для энтеробактерий и синегнойной палочки - 1 мас.%, для микроскопических грибов - 4 мас.%. (таблица 1)

Таблица- 1 Влияние различных концентраций пихтового масла на рост микроорганизмов

Вид микроорганизмов

Концентрация пихтового масла (в мас.%)

6

4

2

1

0,5

Staphylococcus aureus

-

-

+

+

+

Enterococcus faecalis

-

-

+

+

+

Bacillus subtilis

-

-

+

+

+

Escherichia coli

-

-

-

-

+

Enterobacter agglomerans

-

-

-

-

+

Hafnia alvei

Salmonella typhymurium

-

-

-

-

+

Proteus mirabilis

-

-

-

-

+

Proteus vulgaris

-

-

-

-

+

Pseudomonas aureoginosa

-

-

-

-

+

Candida albicans

-

-

+

+

+

Aspergillus flavus

-

-

+

+

+

Penicillium sp.

-

-

+

+

+

Cladosporium sp.

-

-

+

+

+

Контроль МПБ

-

-

-

-

-

Примечания 1 «+»Присутствие роста через 24 часа инкубации

2 «-»Отсутствие роста через 24 часа инкубации

Исследование сочетанного действия пихтового масла с органическими кислотами показало, что наиболее выраженное бактериостатического действие


на рост всех групп микроорганизмов оказывали растворы, содержащие пихтовое масло с янтарной и уксусной кислотой. Молочная, аскорбиновая и лимонная кислоты в сочетании с пихтовым маслом оказывали менее выраженный бактериостатический эффект по отношению ко всем взятым в разработку штаммам микроорганизмов. Экспозиция мясного фарша с добавлением 2% пихтового масла и органических кислот при температуре 37оС в течение 24 часов показала наличие более выраженного бактериостатического эффекта пихтового масла в сочетании с уксусной кислотой, чем с янтарной. (таблица 2)

Таким образом, наличие бактериостатического эффекта позволяет рекомендовать комбинированную смесь из 2% пихтового масла и 1,5% уксусной кислоты для обработки натуральных оболочек (кишок) при приготовлении мясных и колбасных изделий. Кроме того, использование этой смеси, в отличие от используемых в настоящее время в мясной промышленности консервантов, приведет к оказанию дополнительного антиоксидантного эффекта на организм человека и повышению его работоспособность.

3.6 Исследование консервирующих свойств растительных сахаров

Поиск новых веществ, обладающих консервирующими свойствами и, вместе с тем оказывающих благоприятное действие на организм человека, был продолжен в отношении растительных сахаров. Известно, что потребление таких растительных сахаров, как арабиноза, манноза, ксилоза, рибоза и др., предотвращает развитие аномалий сердечно-сосудистой системы, пищеварения, сахарного диабета, онкопатологий. В современной пищевой промышленности в качестве консерванта практическое применение находит только сахароза из сахарного тростника и сахарной свеклы. При ее использовании бактериостатический эффект наступает только при концентрации раствора 50 мас.%. Однако, в ряде случаев это не приемлемо, так как в процессе технологической обработки сырья требуется достижение определенных вкусовых и органолептических свойств, что не возможно при добавлении сахара. Кроме того, использование сахарозы в больших количествах может оказывать неблагоприятное воздействие на обменные процессы организма.

Исследование бактериостатических свойств 15 наименований растительных сахаров на 9 штаммов патогенных, условно-патогенных бактерий и микроскопических грибов показало, что наиболее выраженной антибиотической активностью обладали арабиноза, манноза, ксилоза, рибоза, рамноза, галактоза. Они ингибировали рост всех взятых в разработку микроорганизмов в течение 24 часов в концентрации 12,5 мас.% и, в отдельных случаях, 6 мас.%. Для сравнения сахароза, глюкоза, дульцит, мальтоза, лактоза, рафиноза, маннит, сорбит, мезо-инозит подавляли рост микроорганизмов только при концентрации 50 мас.%. Культивирование микроорганизмов при температуре 37оС в течение 5 суток показало, что ингибирующий эффект сохранялся при применении маннозы, ксилозы, рибозы, рамнозы, галактозы в концентрации 25 мас.%. (таблица 3)




Наиболее выраженной антибиотической активностью обладала арабиноза, применение которой в концентрации 6 мас.% позволяло подавлять рост энтеробактерий в течение суток, а концентрации 12,5% - в течение 5 суток. Для синегнойной палочки, золотистого стафилококка, бациллюсов, дрожжеподобных и плесневых грибов эти показатели составили 12,5 мас.% и 25 мас.% соответственно.

Наличие бактериостатических свойств у перечисленных растительных сахаров, а также их большая роль в формировании гомеостаза организма человека делают необходимым их применение в пищевой промышленности. Управление процессом поступления в организм человека биологически активных веществ может являться мощным, эффективным и экономически оправданным средством оздоровления населения, увеличения работоспособности, продолжительности жизни, повышения уровня здоровья последующих поколений.

3.7 Изучение возможности применения «концентрата йода» при приготовлении функциональных молочных продуктов

Еще одним примером использования веществ, обладающих определенным бактериостатическим эффектом и, в тоже время, позволяющим положительным образом изменять метаболизм организма, является новый продукт ЗАО «Йод ВИЛА» - природный концентрат йода. Его положительное влияние на здоровье уже было доказано рядом ученых из Чехии, Украины, Белоруссии, Латвии и России. В нашу задачу входило определить возможность использования концентрата йода для обогащения молочных продуктов питания. Решение о необходимости изучение свойств этого продукта было обусловлено так же важностью проблемы йоддефицита в Республике Казахстан и необходимостью поисков дополнительных к йодизации соли способов обогащения йодом продуктов питания.

На первом этапе нами были проведены исследования бактериостатического действия концентрата йода. Полученные данные показали, что водные растворы с испытанными концентрациями йода (0,08 мг/л; 0,16 мг/л; 0,32 мг/л) проявили слабовыраженную антимикробную активность в отношении используемых в опыте тест-культур (Salmonella interitidis, Enterobacter aerogenosa, E.coli, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans). Аналогичные результаты были получены и при использовании цельного молока.

В нашу задачу входило определить возможность использования концентрата йода для обогащения молочных продуктов питания. Решение о необходимости изучение свойств этого продукта было обусловлено так же важностью проблемы йоддефицита в Республике Казахстан и необходимостью поисков дополнительных к йодизации соли способов обогащения йодом продуктов питания.

Проведенный анализ состояния микробиоценоза подопытных животных до и после двухнедельного перорального введения 0,16% водного раствора концентрата йода показал не достоверную тенденцию к снижению содержания


в фекалиях мышей патогенных и условно-патогенных бактерий. Содержание симбионтных бактерий (лакто- и бифидобактерий) при этом оставалось на том же уровне. То есть, исследуемый концентрат йода оказывал благоприятный эффект на состояние микробоценоза кишечника подопытных животных.

Следующим этапом исследований явилась изучение устойчивости йода и микробиологических показателей безопасности после различных вариантов тепловой обработки молока (температура, время экспозиции). Как показали полученные результаты, микробиологическая безопасность молока в течение 35 суток хранения достигалась при его стерилизации при 112оС в течение 15 минут. Содержание же йода в готовом продукте после тепловой обработки было несколько выше (вследствие упаривания продукта), чем оно было до стерилизации и оставалось стабильным на течение пятнадцати суток хранения молока (0,19мг/л-0,21 мг/л). На протяжении указанного срока оставались стабильными и другие показатели качества производимого продукта (содержание белка, жира, углеводов, влага, зола, плотность, кислотность, энергетическая ценность).

Проведенные исследования позволили рекомендовать жидкий концентрат йода для производства молочных продуктов. На основе этих рекомендаций ТОО «Обис-Аукат» были разработаны ТУ и наработана опытная партия молочных продуктов - «Йогурта» и «Фруктово-ягодного напитка», приготавливаемого на основе молочной сыворотки, йодированных «концентратом йода».

Исследование динамики содержания йода в процессе 15 суток хранения кисломолочных продуктов («Йогурт» и «Фруктово-ягодный напиток на основе молочной сыворотки») показало, что оно остается стабильным в течение указанного срока хранения (0,16мг/л - 0,2 мг/л) (Рисунок 7).

Показатели микробиологической безопасности готовой продукции в течение 15 дней (на 1, 5, 10 и 15 сутки) свидетельствуют о том, что данная продукция остается безопасной для потребителя в течение всего срока хранения. Показатели пищевой и энергетической ценности продуктов оставались стабильными на протяжении всего времени хранения.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения жидкого «концентрата йода» для обогащения продуктов питания, так как он не оказывает отрицательного действия ни на организм человека, ни на показатели качества и безопасности получаемой продукции.



Рисунок - 7 Динамика содержания йода в молочных продуктах в процессе хранения

Заключение

Известно, что наиболее опасными природным загрязнителям продовольственного сырья и продуктов питания являются микроорганизмы и продуцируемые ими токсины. При этом в последние 30-40 лет наблюдается постоянный рост случаев пищевых отравлений связанных с попаданием в организм вместе с пищей штаммов устойчивых к различным антибактериальным и химиопрепаратам. Этот факт обуславливается, прежде всего, бесконтрольным и часто не обоснованным применением антибиотиков не только в практике терапии воспалительных заболеваний у людей, но и при лечении сельскохозяйственных животных, их откорме. Кроме того, антибиотики в ряде случаев применяются в качестве консервантов в пищевой промышленности. Аналогичный эффект развития устойчивости микроорганизмов к различным факторам окружающей среды описан в ряде работ и при применении консервантов [Донченко П.В., соавт.,1999, Люк Э., 1998, Гуфрій Дмитро, 2000].

Поэтому, с целью предупреждения развития данных патологий, необходимо проводить постоянный мониторинг за их распространенностью, внедрять в практику пищевой промышленности новые пищевые добавки и


консерванты, дающие возможность не только пролонгировать сроки хранения продуктов питания, но и оказывать благоприятной воздействие на биохимические процессы и/или микробоценоз организма.

Проведенные исследования позволили сделать следующие выводы:

1.  Сравнительный анализ антибиотикорезистентности микроорганизмов,
показал, что спектр встречаемости устойчивых к антибиотикам штаммов,
выделенных из биологического материала людей и из продуктов питания
аналогичен. Однако частота встречаемости таких штаммов из биоматериала
чаще, чем из продуктов питания.

2. Усовершенствован метод экстракции антибиотиков из кисломолочных продуктов. Ошибка опыта при его использовании составила не более 3 %, а в случае с общепринятым методом - 10%. При анализе проб кисломолочных продуктов, не содержащих антибиотики, при помощи усовершенствованного метода ложноположительные результаты не отмечены.

3. Добавление в питательные субстраты 2% пихтового масла в сочетании с 1,5% раствором уксусной кислоты тормозит рост широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, дрожжеподобных и плесневых грибов, что дает основание для рекомендации этой смеси в использовании в пищевой промышленности для обработки натуральных оболочек (кишок) при приготовлении мясных и колбасных изделий.

4. Показана возможность использования 25% раствора растительного сахара арабинозы в качестве консерванта при приготовлении джемов и напитков предназначенных для лечебного или специализированного питания.

5. Наиболее приемлемым для получения и хранения восстановленного йодированного молока с нормированными показателями качества и безопасности является режим стерилизации при температуре 1120С (Р=0,5 атмосферы) в течение 15 минут. Содержание йода при использовании жидкого концентрата йода «Йод ВИЛЛ» оставалось стабильным при всех испытанных режимах тепловой обработки в течение 15 дней хранения.

6. Разработанная схема дифференциации энтеробактерий, включающая использование комплексных питательных сред КПС1 и КПС2 и компьютерной программы, которая позволяет повысить эффективность индикации и идентификации микроорганизмов этого семейства при расследовании пищевых отравлений.

Таким образом, поставленные в диссертационной работе задачи исследования выполнены полностью.

Практические рекомендации:

Представленная к рассмотрению работа направлена на совершенствование системы качества и безопасности продуктов питания в РК, а именно:

1. Для разработки эффективных мероприятий по профилактике распространения антибиотикрезистентных штаммов микроорганизмов в объектах окружающей среды и продуктах питания необходимо проведение


мониторинга антибиотикоустойчивости патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являющихся наиболее частой причиной развития воспалительных патологий и инфекционных заболеваний.

2. Внедрение в широкую практику санитарно-эпидемиологических исследований разработанной схемы дифференциации энтеробактерий даст возможность избежать ошибок при их идентификации и, таким образом, повысить эффективность мониторинга за распространенностью антибиотикоустойчивых штаммов. На способ приготовления «Комплексной питательной среды №2» получен патент Государственного патентного ведомства РК за № 15826 от 13.10.94 .

3.В целях повышения точности проводимых исследований по выявлению антибиотиков в молочных продуктах питания необходимо внедрение в практику усовершенствованного метода индикации антибиотиков.

4.  Одним из перспективных способов замены консервантов химического
происхождения на натуральные в пищевой промышленности может явиться
использование арабинозы и пихтового масла в сочетании с уксусной кислотой.

5.     Результаты использования жидкого «концентрата йода» для
обогащения молочных продуктов является еще одним из путей возможного
восполнения дефицита йода.

Обозначения и сокращения СанПиН - санитарные правила и нормы; ГОСТ - Государственный стандарт НД - нормативная документация

КОЕ/г - количество колониеобразующих единиц микроорганизмов в 1 грамме;

УПМ - патогенные и условно-патогенные микроорганизмы;

МПА - мясо-пептонный агар;

МПБ - мясо-пептонный бульон;

ЖСА - желточно-солевой агар;

КПС - комплексная питательная среда;

СИБ - системы индикаторыне бумажные;

ПБДЭ- пластина биохимическая дифференцирующая энтеробактерии;

КМАФАнМ - количество мезофильно-аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

БГКП - бактерии группы кишечной палочки lg - десятичный логарифм.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Меербекова Б.Т., Хаджибаева И.Ф., Багрянцева О.В., Омарова Д.Т., Кутюкова Е.В., Утемуратова Г., Дубовенко В. А. Санитарно-микробиологические исследования окружающей среды, продуктов питания // Матер. Междунар. научно-практической конф. Нутрициональные аспекты проблемы «Экология и здоровье». Ургенч, 1991. - С.145-146.

2. Багрянцева О.В., Омарова Д.Т., Кенбеилова А.С., Хаджибаева И.Ф. Изменение эпидемиологической значимости и вирулентности некоторых представителей энтеробактерий под влиянием антибиотиков // Сборник научных трудов Научного центра региональных проблем питания НАН РК. Алма-Аты, 1993. - С.92-99.

3. Каламкарова Л.И., Багрянцева О.В., Хаджибаева И.Ф. Комбинированная питательная среда для энтеробактерий // Патент РК. -        № 15826. от 13.10.94 г.

4. Каламкарова Л.И., Багрянцева О.В., Пиотровский С.В., Бухарбаева А.С, Адеева В. Н., Рокутова А. В., Хаджибаева И. Ф., Жанбалмааа Х., Хасанова М.А. Контаминация


продуктов питания биологическими и химическими факторами внешней среды // Первый международный конгресс «Экологическая методология возрождения человека и планеты Земля». Алматы, 1997.-С.115-116.

5. Каламкарова Л.И., Багрянцева О.В., Мамонова Л.П., Омарова Д.Т., Адеева В.Н., Бухарбаева А.С., Хаджибаева И.Ф., Рокутова А.В., Афанасьева Л.И., Мулюкина Г.А. Научное обоснование этиологической роли некоторых условно-патогенных микроорганизмов в возникновении различных заболеваний алиментарного происхождения // Сборник Актуальные вопросы нутрициологии. Алматы, 1998. - Вып. 1. - С.107-116.

6. Багрянцева О.В., Хаджибаева И.Ф., Рокутова А.В., Омарова Д.Т., Азнаметова Г.К., Шихова О.М. Роль питания в нарушениях микробиоценоза кишечника. // Матер.междунмар.конф. "Здоровое питание как фактор формирования здорового образа жизни". Алматы, 2000. - С.16-17.

7. Багрянцева О.В., Хаджибаева И.Ф. Разработка новых экологически безопасных консервантов // Матер.междунар наручно-практической конф. «Стратегия развития здравоохранения Казахстана в 21 веке». Алматы, 2001.-С.197-199.

8. Багрянцева О.В., Каламкарова Л.И., Хаджибаева И.Ф. К вопросу о возможности использования бактерицидных свойств пихтового масла в пищевой промышленности // Здоровье и болезнь. 2001. - № 2 .- С. 44-50.

9. Каламкарова Л.И., Мамонова Л.П., Хаджибаева И.Ф., Чайка Е.В., Акимжанова С.М. Некоторые подходы к обогащению йодом различных продуктов питания // Здоровье и болезнь. 2002.- № 3.- С. 15-18.

10. Каламкарова Л.И., Багрянцева О.В., Хаджибаева И.Ф., Рокутова А.В. Ускоренные методы идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. // Матер. междунар. научно-практ конф. «Совершенствование лабораторной диагностики патологических состояний». Алматы, 2003.- С. 96.

11. Багрянцева О.В., Хаджибаева И.Ф., Рокутова А.В., Азнаметова Г.К. Исследование консервирующих свойств растительных сахаров.// Здоровье и болезнь. 2003.- № 5.- С. 68-73.

12.   Каламкарова Л.И., Багрянцева О.В., Хаджибаева И.Ф., Каламкаров Д.
Совершенствование способа дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae,
выделяемых из различных объектов окружающей среды и биоматериала человека.// Здоровье
и болезнь. 2003.- № 5.- С. 73-80.

13. Багрянцева О.В., Каламкарова Л.И., Хаджибаева И.Ф., Адеева В.Н., Бухарбаева А. С. Способ индикации антибиотиков в кисломолочных продуктах.// Матер. Республиканской научно-практ конф. Посвященной 10-летию независимости Респ. Таджикистан, 70 летию со дня образования Тадж.НИИ профилактич. медицины.

Душанбе, 2003.- С. 73-78.

14. Хаджибаева И.Ф. Анализ степени загрязнения пищевых продуктов антибиотиками в Казахстане за 2000-2004г.// Здоровье и болезнь.- 2004.- № 4.- С. 36-39.

15. Каламкарова Л.И., Мамонова Л.П., Хаджибаева И.Ф. Оценка возможности использования «концентрата йода» для производства восстановленного йодированного молока.// Здоровье и болезнь.- 2004.- № 4.- С. 39-43.

16. Каламкарова Л.И., Мамонова Л.П., Багрянцева О.В., Байсеркин Б.С., Ажметдинова А., Куандыкова А., Хаджибаева И.Ф. Основные направления национальной политики в области обеспечения безопасности пищевых продуктов.// Здоровье и болезнь.- 2004.- № 5.-

С. 25-30.

17. Каламкарова Л.И., Мамонова Л.П., Хаджибаева И.Ф. Получение йодированных молочных продуктов с использованием жидкого «концентрата йода».// Матер. Международной научно-практ конф. «Национальная политика здорового питания Республики Казахстан», Алматы, 2004.- С. 117-119.


2006
Автореферат
float(0.257560014725)